卫生论文：比较壁虎不同提取工艺成分的作用及影响
目的比较壁虎不同提取工艺成分对S180和H22荷瘤小鼠的抑瘤作用及免疫器官的影响。方法以肉瘤S180、肝癌H22荷瘤小鼠作为动物模型，以抑瘤率及胸腺、脾脏指数为指标比较壁虎原粉及水煎煮、胃蛋白酶酶解、胰蛋白酶酶解、仿生酶解等不同工艺成分的抗肿瘤作用。结果3种酶解工艺成分对肉瘤S180和H22肝癌抑瘤率均明显高于原粉与水煎煮液，相比模型组有显著性差异(P<0.05)，但对荷瘤小鼠的胸腺指数、脾脏指数无明显影响。结论壁虎酶解工艺成分对S180、H22荷瘤小鼠均有明显抗肿瘤作用。
壁虎，别名守宫、壁虎、蝎虎、天龙，味咸性寒，功能祛风，定惊，散结，解毒。壁虎作为药材始见于《本草经集注》，而《本草纲目》就称其能治“瘰疬初起……血积成痞，反胃膈气，痈疮大痛”。 其可入血分透筋达络，既善破血散结解毒，又能通经活络而止痛。随着壁虎多种药理活性，特别是抗肿瘤活性被发现后[1]， 人们对壁虎的关注度日益提高。目前壁虎临床一般以原粉、水煎煮等方法应用，存在服用量大、易被微生物污染等缺点。现代药理研究表明，动物类药材发挥作用的主要为其小分子肽[2～4]，因此，我们拟采用酶解方法得到其小分子肽，并与常规原粉和水煎煮液比较其抗肿瘤作用的差异。
1 材料
1.1 动物昆明种小鼠，雄性，体质量(20±2)g，购自山东中医药大学实验动物中心，动物许可证号为：SCXK(鲁)20050015。S180腹水小鼠和H22肝癌小鼠均购自山东省医学科学院。
1.2 仪器JJ-2型组织捣碎机，江苏江南仪器厂;摇摆式高速中药粉碎机，浙江大德中药器械有限公司;W-O型恒温水浴锅,上海申顺生物科技有限公司，TDL-5飞鸽牌离心机，上海安亭科学仪器厂;小型切向流超滤系统，美国Millipore公司(密理博)。
1.3 试剂及药品胃蛋白酶(酶活力>1 200 U/g)，胰蛋白酶(酪蛋白转化力≥25.0)，均购自国药基团化学试剂有限公司，注射用环磷酰胺，200 mg/支，江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：08051354，氟尿嘧啶注射液(5-Fu)，上海旭东海普药业有限公司，批号:080302。壁虎购自济南兴旺蟾业，经本校周风琴教授鉴定系壁虎科动物无蹼壁虎Gekko swinhonis Gunther的干燥全体，置干燥箱60℃以下真空干燥，粉碎，过80目筛，细粉备用。
2 方法
2.1 供试品溶液的制备
2.1.1 原粉液的制备取壁虎细粉，用0.2%羧甲基纤维素将其稀释成1 ml∶0.5 g的混悬液，备用。
2.1.2 水煎煮提取液的制备取壁虎细粉，加8倍量水煮沸煮沸60 min，离心，残渣加8倍量水煮沸30 min，离心，合并上清液，浓缩至1:0.5(每毫升药液相当于0.5 g药材，下同)，即得水煎煮提取液。
2.1.3 胃蛋白酶酶解液的制备[5]取壁虎细粉90 g，置于组织捣碎器中，加入5倍量水，匀浆(10 000 r/min)10 min，等分为3份，取1份，煮沸15 min，放冷，调节pH 2.0，移至37 ℃恒温水浴锅中，保温10 min，加入1%胃蛋白酶，2 h后取出，离心(4 000 r/min)10 min，取上清液，微滤(0.22 μm)，超滤(相对分子质量3 000)，收集相对分子质量小于3 000部分，浓缩至1∶0.5，即得胃蛋白酶酶解液。
2.1.4 胰蛋白酶酶解液的制备[6]取“2.1.3”项下一份样品液，煮沸15 min，放冷，调节pH 7.5，移至55 ℃恒温水浴锅中，保温10 min，加入1%胰蛋白酶，3 h后取出，离心(4 000 r/min)10 min，取上清液，微滤(0.22 μm)，超滤(相对分子质量3 000)，收集相对分子质量小于3 000部分，浓缩至1∶0.5，即得胰蛋白酶酶解液。
2.1.5 仿生酶解液的制备取“2.1.3”项下一份样品液，煮沸15 min，放冷，调节pH 2.0，移至37 ℃恒温水浴锅中，保温10 min，加入1%胃蛋白酶，2 h后取出，调节pH 7.5，移至55 ℃恒温水浴锅中，保温10 min，加入1%胰蛋白酶，3 h后取出，离心(4 000 r/min)10 min，取上清液，微滤(0.22 μm)，超滤(相对分子质量3 000)，收集相对分子质量小于3 000部分，浓缩至1∶0.5，即得仿生酶解液。
2.2 抗肿瘤作用的比较[7]
2.2.1 对S180荷瘤小鼠的影响无菌抽取传代8 d的S180腹水小鼠腹腔肿瘤细胞，加入生理盐水调整浓度至4×109个/L，于每只小鼠右腋下注射0.2 ml，接种140只。接种24 h后，将小鼠随机分为7组，每组20只，即模型组、原粉组、水煎煮组、胃蛋白酶酶解组、胰蛋白酶酶解组、仿生酶解组与阳性对照组。模型组灌胃生理盐水10 ml·kg-1，连续10 d;原粉组、水煎煮组、胃蛋白酶酶解组、胰蛋白酶酶解组、仿生酶解组均5 g药材·kg-1药液，连续10 d;阳性对照组腹腔注射环磷酰胺，剂量30 mg·kg-1，连续3 d;给药量均为10 ml·kg-1。第11天，各组动物颈椎脱臼处死，剥离肿瘤、胸腺、脾脏，称重，计算抑瘤率、胸腺与脾脏指数，计算公式如下：
抑瘤率(%)=(空白组瘤重均值-样品组瘤重均值)/空白组瘤重均值×100%
胸腺(脾脏)指数=重量(mg)/体质量(g)
2.2.2 对H22荷瘤小鼠的影响建模方法、给药方式、剂量均同S180荷瘤小鼠(对照组为5-Fu，25 mg·kg-1)。
2.3 统计学方法实验数据采用SPSS 10.0统计软件进行分析，所有测定数值以±s表示，采用方差分析法进行分析，P<0.05为有显著性差异，P<0.01为有极显著性差异。
3 结果
3.1 对S180荷瘤小鼠的影响
3.1.1 对S180荷瘤小鼠抑瘤率的影响结果见表1表1 对S180荷瘤小鼠抑瘤作用的影响
3.1.2 对S180荷瘤小鼠脾脏、胸腺指数的影响结果见表2表2 对S180荷瘤小鼠免疫器官的影响
3.2 对H22荷瘤小鼠的影响
3.2.1 对H22荷瘤小鼠抑瘤率的影响结果见表3表3 对H22荷瘤小鼠抑瘤作用的影响
3.2.2 对H22荷瘤小鼠脾脏、胸腺指数的影响结果见表4表4 对H22荷瘤小鼠免疫器官的影响
4 讨论
壁虎在临床上常用于肿瘤，特别是消化道肿瘤的治疗，一般焙干研细或水煎煮入药，但壁虎起抗肿瘤作用的物质基础还不清楚。小分子肽抗肿瘤作用逐渐引起了人们的注意。越来越多的研究表明，动、植物含有小分子肽具有很好的抗肿瘤作用，世界上许多国家正在竞相研究开发小分子肽类抗肿瘤的防治药物，如谷胱甘肽、海参五肽、槲寄生肽、胸腺五肽等[8，9]。本研究运用酶解的方式，使壁虎含有的蛋白类成分
