RT-PCR检测SARS冠状病毒的若干分析
摘 要 〔目的〕建立一步法RT-PCR方法,对非典型肺炎疑似病例进行SARS相关冠状病毒检测。代写医学论文〔方法〕参照WHO公布的PCR检测SARS相关冠状病毒的引物序列,我们合成了4对引物,利用RT-PCR技术建立一步法检测SARS相关冠状病毒的方法。〔结果〕利用该方法对武汉市非典型肺炎疑似病例进行SARS相关冠状病毒检测,其中样品W20用4对引物检测均在相应的位置出现了DNA条带,样品W1只有BNIin-s/ as引物出现预期产物。同时我们将W20的BNIin-s/ as引物扩增的109bp产物进行了序列测定,结果显示该片段序列与其他地区和国家的SARS冠状病毒的同源性极高,均在99.5%以上。〔结论〕一步法RT-PCR扩增产物是SARS冠状病毒基因片段,我们建立的一步法RT-PCR是一种可靠的检测方法。
关键词 SARS冠状病毒 一步法 RT-PCR 检测方法
Abstract 〔Objective〕To establish assays of one-step RT-PCR for detection of SARS associated coronavirus;〔Method〕Ac-cording to PCR primers for SARS developed by WHO network laboratories we synthesize 4 primer pairs: BNIin-s/ as、BNIout-s/as、SAR1-s/ as、COR1/COR2 and establish assays of one-step RT-PCR for detection of SARS associated coronavirus by RT-PCRtechnology.〔Results〕20 specimens from SARS probable cases in Wuhan were test by the one-step RT-PCR assay, specific DNAfragments as predicted were produced from specimen W20 by the assays using all 4 primer pairs, while one specific DNA fragment wasproduced from specimen W1 using primer pair BNIin-s/as. The primer pair BNIin-s/ as PCR products from W1 and W20 were se-quenced and the sequence showed high identitytothat of all SARS associated coronavirus in GenBank;〔Conclusions〕The results showedthat PCR products from W1 and W20 by our assays was specific for SARS associated coronavirus and the assays of one-step RT-PCRfor detection of SARS associated coronavirus established by us were reliable.Key words coronavirus;one-step RT-PCR;assay
严重急性呼吸综合征(Severe Acute Respiratory Syndrome,SARS),即传染性非典型肺炎(简称非典),是指目前病原尚不完全明确,近期在我国局部地区发生流行,主要通过近距离空气飞沫传播的一种呼吸道传染病,临床主要表现为肺炎,在家庭和医院有显著的聚集现象的感染性疾病[1]。据WHO统计,截止2003年5月16日,全球累计30个国家和地区、7739人感染SARS,死亡611人[2]。SARS最先于2002年11月中旬在我国广东省境内出现,随后世界上许多国家也相继报道了SARS感染,随即全球的科学家在病原的寻找、分离鉴定、SARS冠状病毒的基因序列分析进行了不懈的努力,2003年4月16日WHO宣布SARS病原是一种变异的新冠状病毒。由于SARS病原确认时间较短,目前还难以从市场上得到经过权威机关认可的SARS检测试剂。为此我们建立了一步法RT-PCR检测SARS冠状病毒技术,用于临床上SARS疑似病例的检测,现将实验结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 样品
SARS疑似病例患者的痰液、喉嗽液、血液标本均严格按照卫生部的指导原则在武汉市传染病医院采集[3],编号分别为W1、W18、W20,其中编号为W20的患者是刚从疫区回来的老师,有明显的流行病学接触史。
1.2 PCR引物
参照WHO在2003年4月17日公布的用于RT-PCR检测SARS冠状病毒的引物序列[4],我们合成了BNI-in-s/as、BNIout-s/as、SAR1-s/ as、COR1/COR2、IN2/IN4、IN6 IN7共6对引物,经国际互联网在线BLAST分析,发现IN2/IN4、IN6/IN7两对引物与GenBank中SARS冠状病毒基因同源性较差,故而舍弃不用。其余四对引物序列以及在SARS冠状病毒TOR-2基因(GenBank序列号:AY274119)上的位置。
1.3 RNA抽提
患者的痰液、喉嗽液、血液标本中RNA抽提采用GSL溶液(4M异硫氰酸胍,25mM柠檬酸钠,0.5%十二烷基肌氨酸钠),具体方法简述如下:取SARS疑似病人喉嗽液1ml,台式离心机8000r/min离心2min,将沉淀悬浮在200μl的TE缓冲液(10mMTris,1mM EDTA,pH8.0)中,加入400μl GSL溶液,400μlTE缓冲液饱和的重蒸酚,100μl水饱和的氯仿:异戊醇(24:1),每加一种试剂均充分混匀。10000r/min离心15min,收集水相,向水相中加入2μg酵母tRNA,1/10体积3M醋酸钠,2体积无水乙醇,-20℃沉淀1h以上,16000r/min离心15min回收核酸,将核酸溶解在20μl无核酸酶水中,-70℃备用。痰液、血液标本中RNA抽提采用相同方法。
1.4 一步法RT-PCR检测SARS冠状病毒
SARS冠状病毒检测采用Qiagen一步法RT-PCR试剂盒(Qiagen Ltd.)进行。RT-PCR反应混合液按试剂盒推荐配方配制:5倍RT-PCR缓冲液10μl,5倍Q溶液10μl,10mMdNTP 2μl,20μM上下游引物各1.5μl,RT-PCR酶溶液2μl
1.5 PCR产物的序列测定和同源性比较
在紫外灯下将RT-PCR扩增的产物小心切出,并用玻璃奶DNA回收纯化试剂(北京原平浩生物技术公司)进行回收纯化,以PCR引物用ABIPRISM 370 DNA序列分析仪进行双向序列测定,并利用序列比较软件GeneBee将测定结果与其他SARS冠状病毒基因序列进行同源性比较。
2 结果
2.1 采用一步法RT-PCR对RNA进行检测
采用一步法RT-PCR对在武汉市传染病医院采集的临床上疑似SARS感染患者的喉漱液中提取的RNA进行了检测,结果样品W20应用BNIin-s/as、BNIout-s/as、SAR1-s/ as、COR1/COR2等4对引物分别扩增出大小为109bp、190bp、121bp、311bp的产物;样品W1应用4对引物进行检测,只有BNIin-s/ as引物对扩增出大小为109bp的产物(图1);而样品W18未扩增出相应的条带。这些RT-PCR产物与我们根据SARS冠状病毒TOR-2基因(GenBank序列号:AY274119)推断的产物大小相吻合,根据这个结果可以初步判断样品W1、W20为SARS冠状病毒阳性,我们建立的SARS冠状病毒一步法RT-PCR检测方法成立。
2.2 一步法RT-PCR检测结果的确认
为了确认W1、W20两个标本中RT-PCR扩增的产物是SARS冠状病毒基因片段,我们将引物对BNIin-s/as扩增产物,用玻璃奶对其进行了回收纯化,以PCR引物进行序列测定。从测序结果来看,W1和W20的扩增产物的长度均为109bp,正好与SARS冠状病毒TOR-2以引物对BNIin-s/as扩增长度一样。利用同源性分析软件GeneBee将W20的扩增产物序列与GenBank中登记的我国及其他国家的9株SARS冠状病毒的基因序列进行同源性分析发现,109bp的RT-PCR扩增产物基因序列与它们具有极高的同源性,均大于98%。证明我们应用BNIin-s/as、BNIout-s/as、SAR1-s/as、COR1/COR2等4对引物从W20中RT-PCR扩增的产物是SARS冠状病毒基因片段,我们建立的一步法RT-PCR是一种可靠的SARS冠状病毒检测方法。
3 讨论
由于SARS病原确认时间比较短,目前还没有成熟大家普遍接受的SARS检测方法,不同国家的研究者们正在研究快速而准确的SARS冠状病毒的实验室诊断性检测方法,虽然国内已经有卫生部批准的SARS冠状病毒特异的IgG、IgM抗体ELISA检测试剂盒的问世,但从SARS冠状病毒感染到人体内产生特异性的IgG、IgM抗体需要一段时间,据世界卫生组织认为,ELISA试剂盒用于SARS病例的血清中的IgG、IgM抗体检测,大约在疾病开始后的21天出现可靠的阳性结果[5]。因此IgG、IgM抗体出现的滞后,将使这种方法难以对SARS冠状病毒感染进行早期诊断。本研究采用一步法RT-PCR直接检测SARS冠状病毒的RNA,不管体内是否产生特异的IgG、IgM抗体,都可以进行SARS冠状病毒感染早期诊断。同时我们对武汉市SARS病人和疑似病例检测中发现,检测SARS冠状病毒RNA的一步法RT-PCR比检测特异性IgG、IgM抗体ELISA至少提前6天检测到SARS冠状病毒感染(另文报道)。根据WHO的建议[6],SARS冠状病毒的PCR检测阳性结果,必须经过第二个实验室测试,或者经过从原始标本开始重复PCR方可证实,另外也可以通过扩增第二个基因片段增加检测的特异度。本研究通过4对SARS冠状病毒特异性引物,用来扩增SARS冠状病毒的不同区域,进一步增加检测的特异度,从而建立了一步法RT-PCR直接检测SARS冠状病毒RNA技术,为临床早期诊断SARS病人提供了基础。从本次样品的检测结果并结合临床特征和流行病学资料分析,W20可以肯定是SARS病人,W18基本可以排除,但对于W1,4对引物检测只有BNIin-s/as引物出现阳性结果,而其他引物检测均为阴性,但临床特征和流行病学资料又不能排除,推测可能是采集标本时病毒数比较少,因此有待于进一步研究。
参考文献
[1]卫生部疾控司,非典型肺炎防治技术方案,2003.
[2] http://www. who. int/csr/sars/country/2003_05_16/en/, CumulativeNumber of Reported Probable Cases of Severe Acute Respiratory Syn-drome (SARS),2003-5-17.
[3]卫生部.传染性非典型肺炎病毒研究实验室暂行管理办法[S].非典型肺炎病例实验室检测标本采集技术指南(试行),2003.
[4] http://www.who.int/csr/sars/primers/en/,PCR primers for SARS devel-oped by WHO NETWORKLaboratories,2003-4-17.
[5] http://www.chinacdc.net.cn/feiyan/5.2/who5.2_3.htm,严重急性呼吸综合征(SARS):实验室诊断性测,2003-4-29.
[6] http://www.chinacdc.net.cnhttp://www.51lunwen.com/clinical//feiyan/5.2/who5.2_2.htm,采用PCR实验室检测SARS冠状病毒RNA的建议,2003-4.
