[摘要]研究套式代R在检测抗一HBs阳性不同模式者血清HBVDNA中的意义，从基因角度分析产生的原因。对麟例标本采用套式咒R检测HBVDNA并作序列分析，荧光定量法检测HBVDNA含量。抗一HBs阳性不同模式者常规代R法检测HBVDNA阳性率29.7%，套式PCR检测阳性率84.4%;套式PCR阳性组肝功能损害严重、HBVD-NA与IIBsAg值显著高于套式代R阴性组;套式PCR性阴/常规PcR阴性组48.6%的病例由于S基因变异导致IIB-巍肤氨基酸置换产生的，抗一HBs不能中和病毒而与HBvDNA共存。因此对那些抗一HBs阳性、肝功能反复异常者有必要进行套式代R检测，以提高HBv感染的诊断率。
HBVDNA是乙型肝炎病毒感染及复制最直接和可靠的标志。有报道单一抗一HBs阳性HBvDNA检出率n.8%，抗一HBs阳性、肝功能反复异常者血清和肝活检免疫组化证实39.7%系HBv感染[‘〕。我院对乙肝病毒血清标志物(HBVM)抗一HBs阳性不同模式者血清HBVDNA进行研究，发现套式PCR能显著提高抗一HBs阳性者血清HBVDNA的检出率，现将结果报告如下:
1材料与方法
1.1研究对象:64例均为1999年6月一2(XX)年12月我院门诊及住院的患者，男43例，女21例，年龄38.9士12.6岁，急性肝炎6例、慢性肝炎47例、慢性无症状携带者n例。诊断符合2(XX)年第十次全国病毒性肝炎及肝病学术会议修订的标准。1.2方法:1.2.IH丑VM以IN压系统检测，I呱全自动快速免疫发光分析仪及试剂由美国ABB01，11公司提供。1.2.2套式PCR检测HBVDNA及序列分析将100川血清用经典酚氯法常规提取HBVDNA作模板，加人P1、凡引物在扩增体系中扩增:94℃预变性3而n，男℃455，58℃455，72℃455循环25次，最后72℃5而n。产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，再加人P3、P4引物第二次扩增:94℃预变性2而n，94℃305，55℃305，72℃305，循环35次，最后72℃5而n，产物经琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察，513bP处存在荧光条带为阳性。鉴定后GIA甲ick纯化柱纯化。纯化产物及玛或P4引物加人测序试剂盒，置ABI310型DNA测序仪进行测序反应。HBV扩增引物由上海复旦遗传所提供，上海生物工程公司合成，S基因外侧正义引物P15’一代CCA于Cn刃陀以C-CTCrAA一3’，反义引物咒5’一CA卫劲LAGT-TACA〔:TCCrrCCT(;(;AC件一3’反义引物P45’一CCC-CAATACCACATCA代CA一3’，末段荧光标记测序试剂盒由美国Perkin一Ehaer(PE)公司提供;QIAqllick纯化柱为德国Giagen公司产品;GeneAlnl〕9。汉〕扩增仪和ABI310型DNA测序仪由PE公司生产。1.2.3定量PCR检测采用A川plisensorPCR测定J址清HBVI)NA拷贝数，按操作说明进行。试剂由美国BiotronicS公司提供。1.3统计学处理:采用S邢58.0进行两样本均数之间的比较，经方差齐性分析后，选择t或t’检验;构成比的差异性比较用护检验。
2结果
2.164例血清标本常规PCR检测HBVDNA阳性率29.7%(19/64)，套式PCR法阳性率84.4%(54/研)，护二39.1，p<0.01有显著性差异。2.2套式PC形常规PCR各组生化结果比较，其中白蛋白、球蛋白各组无显著性差异。2.4套式PCR(十)/常规PCR(一)组基因测序结果与基因库序列及无锡地区HBsAg、HBe雌、抗一HBc阳性急性肝炎患者S基因序列比较:17(48.6%)例出现了S基因第C14OA、C188G、T245G、贷肠G、竹68A厂巴72G、C30lG、A343T、A376G、T415G厂科以)G位核昔酸多位点的替换，导致HBsAg肤TH川Lnl币35、此ZA、1另gA、C9()S、L91A、H101A、THrll5S、1126A、C139G、5154A位氨基酸置换。
3讨论
本资料显示抗一HBs阳性不同模式中常规PCR比套式PCR对HBvDNA检测的阳性率为低，应该引起我们重视。套式PCR阳性组与套式PCR阴性组比较，前者肝功能损害较重、HBsAg(P/N)滴度高，HBvDNA含量高。提示套式PcR阳性组的患者体内有病毒复制和肝脏炎症反应。因此，对那些抗-HBs阳性肝功能反复异常，常规PCR阴性者有必要进行套式PCR检测以提高HBV感染的检出率。一般认为抗一HBs是HBsAg刺激机体后产生的保护性抗体，是HBV感染后出现免疫力的标志。我们的研究发现抗一HBS与HBVI)NA同时存在时，提示此时抗一HBS未能起到中和HBV的作用。VanNtlllenlzl报道慢性肝炎者抗一HBs对HBs纯的中和作用并不如预想的那么有效，因此需联合使用抗病毒药物接受乙肝疫苗后产生的抗一HBS有时能误导我们认为产生了免疫力，而实际上仍存在HBV的慢性感染图;在抗一HB，和HBVI)NA共存者中存在基因变异[4一7〕，导致抗一HB，几近丧失对HB人的中和作用。我们对套式代R阳性/常规PCR阴性血清HBVDNA基因测序结果同样发现:HBsAg“a’’决定簇及其两外侧端的氨基酸存在变异，导致抗一HBs不能中和病毒而与】mVDNA共存，病毒低水平复制。
